液相色譜儀分析肉食品中常見4種抗生素殘留

   大環內酯類與氯霉素類藥物是兩類應用廣泛的廣普抗生素，由于這兩類抗生素能夠有效預防和治療家畜傳染病和寄生蟲病的發生，有些還具有促進動物生長發育的功用。因此，為了降低養殖成本，提高經濟效益，在家畜養殖中廣為使用。但是，近年來由于在禽畜養殖過程中過量使用抗生素又不遵守休藥期的規定，在牛羊肉、豬肉以及雞鴨魚肉中檢測出了各種抗生素。這種殘留可以通過食物鏈進入人體，進而對人體造成各種危害。紅霉素、泰樂菌素等大環內酯類可致肝損害和聽覺障礙。更嚴重的是長期大量濫用廣譜抗生素會導致腸道微生物菌群被抑制，使人體產生抗藥性，這種抗藥性導致人類感染疾病之后治療難度加大，治療成本升高。　　為了保障人類的生命健康，世界各國衛生組織以及食品藥品監督管理部門都已經將肉食品中各種抗生素殘留量作了嚴格規定，并且以抗生素在肉食品中的殘留量作為產品進口的貿易壁壘，如美國和歐盟對阿維菌素在肉食品中的zui高殘留*為25ug/kg，泰勒菌素為100ug/kg，替米考星為100ug/kg，伊維菌素為40ug/kg。目前肉食品中大環內酯類抗生素常用液一質聯用進行全面分析。氯霉素類藥物常用氣相色譜及液相色譜分析。而用液相色譜法同時分析肉食品中兩類常見抗生素還未見文獻報道。

   一、LC2100高壓恒流泵：2臺
      uv2100紫外檢測器：1臺 N2000色譜工作站：1臺7725i手動進樣閥：1套

   色譜工作站：1套 

   二、LC2100液相色譜儀特點

★采用世界上zui的光學檢測系統（安捷倫液相色譜檢測系統），交差光路設計

★輸液泵單向閥來源自世界zui的輸液泵技術

★  傳承了美國瓦里安技術，確保了泵的可靠性及穩定性

★  檢測器采用了安捷倫科技技術

★  在國內同行業真正不需換燈，實現全波長可變檢測分析

★  智能化高，可實現網絡化平臺監控，提高了你的QC效益。

★  自動化，讓你從繁鎖的分析操作中解放出更多的時間！

技術特點

★ 輸液泵單向閥來源自瑞士進口、密封圈來自美國*、氘燈以及氘燈電源來自德國*、管路和各種接頭來源自美國*

★ 泵形式：串聯雙柱塞 浮動式密封圈；泵頭自沖洗功能，泵無須手動排空即可輸液

“自吸式單向閥"技術，可延長密封圈使用壽命；

★ 程序化的溶劑類和壓縮因子，可自動補償；完整的預清洗功能，更于快速溶劑更換

★ 三條流量校正曲線以及*的多點參數校正，保障了*的流量準確性； 

★ 梯度：高壓2-3元；梯度方式：高壓，梯度洗脫內部軟件可自控制，可通過PC機及泵控制

★ 紫外檢測器具有自動波長定位調整，自動調零，多量程輸出選擇

★  D2燈（德國原裝）：壽命3500小時，保證使用2000小時

  三、高壓恒流輸液泵技術參數：

四、紫外可見檢測器技術參數

三、實驗

　　1 儀器與試劑

　京科瑞達　 LC-2100高壓恒流泵

　　uv2100紫外檢測器

　　超聲波清洗儀　　　　　　　　　　　　　

　　反相色譜柱C18　　

　　固相萃取柱　　　　　　　　　　　　　　　

　　泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考標準品均為天津市科密歐化學試劑開發中心監制　

　　乙腈、正己烷均為優級純　

　　其它試劑均為分析純　

　　實驗用水均為二次蒸餾水　

　　新鮮牛肉與雞肉均為超市所購

　　2 色譜條件　　　　　　　　　　　

　　C18反相色譜柱　

　　柱溫25℃，流速1mL/min，進樣量25uL，梯度洗脫條件A相為甲醇，B相為0.2mol/L磷酸二氫鈉含10%(體積比)甲醇，調節pH為3.0，梯度洗脫程序：0-2min10%A，2-8min 10%-40%A，8-9min40%-10%A，檢測波長入為275nm

　　3 標準溶液的配制及標準曲線的制備

　　分別準確稱取各標準品0.01g（至0.001g），用甲醇分別溶解并定容至100mL，配制成100mg/L標準儲備液，于一4℃冰箱中冷藏，測定時將各標準溶液混合后稀釋成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/L的溶液。分別以泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數（r）。

　　4 樣品處理

　　將新鮮牛肉及雞肉分別勻漿后，于-18℃冰箱中保存。測定時，將勻漿冷凍保存的牛肉與雞肉樣品于室溫下自然解凍。分別準確稱取20.0g樣品置于50mL具塞錐形瓶中，加入20mL乙腈，超聲10min，轉移至離心管，以5000r/min離心10min，收集上清液，離心沉淀物用上述方法重復提取2次，合并上清液。向得到的清夜中加入30mL正己烷，用力振蕩5min，靜置分層，棄去上層正己烷層。然后將溶液于40℃減壓旋轉蒸發至約2mL，氮氣吹干后加入5mL甲醇一磷酸鹽混合液超聲溶解抗生素，定容至10mL。　　　

　　5樣品凈化

　　將HLB固相萃取小柱用5mL甲醇、5mL去離子水活化后，將4得到的樣品處理液上固相萃取柱(柱流速保持1滴/s），用10mL蒸餾水、10mL5%甲醇水溶液淋洗固相萃取柱，再用10mL甲醇洗脫，將洗脫液用氮氣吹干后，加入流動相超聲定容至5mL，zui后，經0.22um濾膜過濾后進樣。　　　　

　　6方法的準確度、精密度、線性范圍、回收率

對于牛肉樣品分別添加0.1、0.5、1.0mg/kg 3個水平的混合標準溶液，按照4與5樣品處理及凈化方法，每個水平平行測定4次，進行回收率實驗，并且以3倍信噪比分別計算泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在牛肉樣品中的檢出限，在測定條件下4種藥物在0.1—20mg/L范圍內均呈線性，線性方程與相關系數、平均回收率、相對標準偏差見表 　

 7、實際樣品檢測

本實驗分別對10份牛肉樣品和10份雞肉樣品中泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考進行檢測，沒有發現牛肉樣品中含有以上抗生素，但是在4份雞肉樣品中都不同程度檢測到了泰樂菌素，zui高為200ug/kg，zui低為80ug/kg，平均含量為120ug/kg，高于我國動物性食品中獸藥zui高殘留*（100ug/kg）

        我國動物性食品中獸藥zui高殘留*規定泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在肉品中的zui高殘留量（MRL）分別為100、75、1.5、200ug/kg，本實驗所測泰樂菌素、替米考星、氟苯尼考的檢出限分別為20、32、16ug/kg均在zui高殘留*以下，符合殘留檢測分析要求。由于氯霉素藥物特殊性，歐盟對氯霉素的檢出限要求為0.1ug/kg，美國FDA對氯霉素的檢出限要求為0.3ug/kg，按照本實驗方法，氯霉素檢出限為19ug/kg，還未達到上的要求，這是因為提取方法和所用檢測器所致。今后應該發展更加靈敏的方法以提高氯霉　素。本實驗方法的平均回收率較高（75%-87%），而且步驟簡單、操作容易、重現性較好　相對標準偏差為1.35%-5.41%，表明方法穩定可靠。